透明质酸酶的研究进展

　　【摘要】透明质酸酶是一类能够降解透明质酸酶的酶的总称，广泛分布于自然界，存在于哺乳动物、昆虫、水蛭和细菌中。近年来，关于透明质酸酶的研究逐渐增多，其在医学、整形等领域的应用受到人们的重视。文章介绍了透明质酸酶的研究进展，对于其分类、来源、活性测定和应用进行了综述。
　　【关键词】透明质酸酶；分类；来源；活性测定；应用
　　透明质酸酶（Hyaluronidases，简称HAase）是一种广泛分布、能够降解透明质酸（HA）产生低分子化的酶的总称〔1〕，大多数能够降解硫酸软骨素（Chondroitin，CS），但速度较低。最初发现透明质酸酶，是在1928年，发现睾丸及其他组织中的提取物，通过促进其他有害的毒液成分的渗透和增强它们在血液中的行动不变性组织，发挥扩散因子的作用。1940年，Meyer将这种扩散因子正式命名为Hyaluronidase。不同来源的HAase具有一定的差异性，但从其被发现以来，逐渐获得了人们的关注，已经被广泛应用于医药等领域。也基于此，HAase的性质等相关研究成为了一个值得关注的领域。
　　一、透明质酸酶酶的分类
　　根据透明质酸的作用机理，将HAase分为三种类型（Meyer，1971）：（a）内酰胺N乙酰D氨基葡糖苷酶（EC3。2。1。35）：该酶属于水解酶，将高分子量底物（HA）作为主要末端产物的通过内切的作用方式，作用于1，四糖苷键进行水解，降解后得到的终产物主要为饱和的四糖和六糖。来自于膜翅目（Hymenoptera）毒液和哺乳动物精子等动物来源的均属于此类。该的酶也催化转糖基反应，在HA的水解期间产生六糖和八糖。与后面两种透明质酸酶不同的是，这一组不仅作用于HA，还作用于硫酸软骨素。（b）葡糖苷酸酶（EC3。2。1。36）：来源于水蛭和钩虫中，属于水解酶，通过内切作用方式，作用于1，3糖苷键，降解后得到的终产物为四糖，且该酶为特异性降解HA。（c）透明质酸裂解酶（hyaluronatelyase，简称HL）（EC4。2。2。1）：多数是以细菌为代表的，还包括真菌和病毒来源的一组酶，通过消除机制的N乙酰己糖胺酶，通过作用于1，4糖苷键，在C4和C5之间引入不饱和键。与前两种HAase不同，HL的最终产物是二糖而不是四糖或六糖。不同菌属来源的HL，在底物特异性上表现有所不同。
　　随着分子生物技术的发展，还可以将HAase分为两大类，依据其蛋白同源性，将其分为真核生物来源的HAase和原核生物来源的HAase。
　　二、透明质酸酶的来源
　　透明质酸酶的来源广泛，分布于各种脊椎动物（睾丸、动物毒液等）和无脊椎动物（昆虫、水蛭，十二指肠虫等）中，还存在于微生物中（链霉菌属，葡萄球菌属、梭菌属等）。
　　（一）真核生物来源的HAase
　　在人类基因组中已经发现了六种HAase相似序列的基因编码，它们都显示出高度的同源性。它们包括人类的HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4和PH20，以及在人类中转录但未翻译的假基因HYALPhyal1。前三个来源于人的HAase基因（HYAL1、2、3）聚集在染色体3p21。3位点，而后者的3个基因在染色体7q31。3位点上聚集。在此基础上，HAases被分为两部分。它们大多数被认为是酸性的，因为它们的活性在酸性条件下最高。相反，PH20是中性活跃的HAase，因为它在中性pH中活性最高的，商品化的重组人透明质酸酶的氨基酸序列是PH20，其在医药领域应用广泛，是已发现的人类透明质酸酶唯一一个最适宜体内的中性生理环境同时保持高活性的酶〔2，3〕。2015年，美国FDA批准一种名为Halozyme的重组人类透明质酸酶注射剂，作为其他注射药物的辅助药物，用于皮下注射等促进药物扩散和吸收，但是重组人透明质酸酶价格昂贵，无法实现大规模应用，市面上目前只有国外能够购买到该种酶，且由于其的免疫原性，使之不能随意购买，因此想要使其能够在我国医药领域广泛使用，现在的情况不是很乐观。
　　目前市售的HAase中应用最为全面的是来自于牛睾丸提取的透明质酸酶（bovinetesticularhyaluronidase，简称BTH），最初是PrimaPharm公司研制的纯化牛睾丸透明质酸酶。BTH为中性HAase，主要将HA降解，终产物四糖和饱和二糖，且其还可以降解其他种类的糖胺聚糖硫酸软骨素。但提取后的该酶纯度低，掺杂了许多杂蛋白，无法保证酶的纯度，且其由于来源于动物，具有较强的免疫原性，容易引起过敏反应。
　　来自水蛭和十二指肠虫等的葡糖苷酸酶（EC3。2。1。36）作用于13糖苷键之间。这种类型的酶还有待进行深入研究。其水解降解机制类似于脊椎动物的HAase。然而，在研究它们的催化机理时，该类型的酶与脊椎动物的HAase降解模式的差异仍然存在。
　　（二）原核生物来源的HAase
　　在CAZy数据库中，微生物来源的透明質酸酶属于多糖裂解酶第8、16家族（PL8、PL16），有些噬菌体也能产生透明质酸酶，但是它的分子量远小于细菌HAase的分子量，而且在胞外环境下测得的活性很低。
　　多种细菌、噬菌体、真菌可表达产生HL，通常称其为消除酶或裂解酶（EC4。2。2。1），通过消除机制引入不饱和双键。很多细菌都可以产生HL，其中革兰氏阳性菌（Grampositive，G），经报道，大多属于致病菌例如链球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、〔4，5〕等，这些致病菌通过动物或人类的皮肤擦伤，逃过其防卫机制引起感染。过程是其将自身的HL分泌到胞外通过降解宿主体内的透明质酸，使宿主体内的高分子HA参与免疫调节且具有抗炎活性，而微生物产生的HL将高分子HA降解成寡聚透明质酸，使其作为炎症反应的诱导因子，在宿主体内建立适合该细菌自身的生长环境，使宿主患滑膜炎、败血症等的风险大大提高。而来自革兰氏阴性菌（Gramnegative，G）中的HL，则属于周质酶，为胞内酶，在发病机制中起作用的可能性较小，其中一些HL也有较低的软骨素裂解酶活性。细菌和真菌来源的HL，分子量一般较大，而细菌来源的酶纯化工艺较简单，且来源更广，成本较低，因此其市场应用价值更高。许多噬菌体产生的酶通常随噬菌体附于细菌膜表面，膜中所富含的HA利于其生长，通过初始的非渐进性的内溶活性来消化HA，然后以不饱和二糖作为最终产物。
　　病毒来源的HL蛋白序列与细菌来源的相似性极低，且分子量远小于细菌和真菌来源的。研究发现，有些不饱和透明质酸寡糖，例如由噬菌体透明质酸酶HylP〔6〕产生的不饱和透明质酸寡糖，不仅不会促进乳腺癌细胞的生长，还可以减少乳腺癌细胞的增殖、转移和入侵，因此可能可以利用HylP独特的酶活性抑制透明质酸介导的肿瘤生长和进展。来源于酿脓链球菌的透明质酸裂解酶对降解HA后得到不饱和透明质酸具有一定的抗氧化活性，而这些功能是饱和透明质酸片段无法达到的，因此微生物产生的HL对于降解产生不饱和透明质酸寡糖的这些特殊的生物学功能具有更广阔的应用前景。
　　三、透明质酸酶活性的测定方法
　　随着对透明质酸酶的深入研究，经文献报道，常见测定透明质酸酶活性的方法很多，如ELISAlike法、平板法、化学修饰法和毛细管电泳法等诸多方法。但应用较多的是浊度法、3，5二硝基水杨酸法（3，5dinitrsalicylic，DNS）和232nm法等方法。
　　濁度法：大分子量的透明质酸盐在酸化血清中能够发生沉降现象，但是经过降解的HA在相同条件下仍然澄清。经过不断的研究，对浊度法不断修正，发现马、兔和人血清、血清白蛋白、牛血清白蛋白、十六烷基三甲基溴化氨和西吡氯铵等均可以作为蛋白沉淀试剂均可以用来测定酶活性，可使用马血清作为沉淀剂。美国药典（采用马血清作为沉淀剂，透明质酸酶是以USP标准透明质酸酶（USPHyaluronidaseReferenceStandard）为标准酶进行酶活测定。中国药典（版）也是釆用血清作为与反应的沉淀剂，以标准酶作为标准品进行酶活测定。酶活定义：在特定温度条件下，0。1mgHA在30min内引起的浊度降低50引起的浊度变化所需的酶量定义为1个酶活力单位。
　　DNS法：3，5二硝基水杨酸法（3，5dinitrsalicylic，DNS法），原理是在碱性环境中DNS与透明质酸酶的降解产物的还原性末端发生化学反应，反应产物煮沸后呈现红棕色，颜色深浅在一定范围内与还原糖含量呈线性关系，还原糖含量越高，颜色差越明显，585nm下检测获得还原性糖的量来反映酶活力。酶活力定义：以每10min产生1nM还原糖需要的酶量定义为一个酶活力单位（UmL）。
　　232nm法：糖胺聚糖裂解酶与糖胺聚糖底物反应会产生不饱和双键，这种不饱和双键在232nm处具有光吸收，在一定范围内，吸光度值与不饱和双键的含量呈线性关系，因此可以通过测定OD232下光吸收的数值来检测底物中不饱和双键的数量，进而显示产物的生成量来确定酶活力的大小。酶活力定义为：每分钟催化产生1mol还原糖所需的酶用量定义为一个酶活力单位（U）。
　　四、透明质酸酶的应用
　　首先，可以应用透明质酸酶来制备低分子透明质酸和透明质酸寡糖，从而使低分子透明质酸（LMWHA）和透明质酸寡糖（oHA）可以发挥其生物学功能，促进新生血管生成、促进创伤愈合、抑制肿瘤等作用。有报道表明HAase降解产生的oHA可以促进预产大鼠子宫颈收缩，从而缩短生产过程，HAase还有助于恢复大鼠损伤的脊髓的功能。
　　其次，由于最初作为扩散因子被发现，因此，透明质酸酶可以与其它药物共同作用进行给药，促进药物的扩散和吸收。当用作为单次短期作用剂量，暂时地去除可被用来增强将溶液和药物吸收入组织，使其组织液的黏度降低，从而增加膜的通透性将药物传送入间质空间。HAase对于麻醉剂的扩散是有效的，有助于治疗性流体、分子和蛋白质的治疗性的物质的扩散给药。
　　HAase可以用于眼科手术帮助麻醉，青光眼、白内障手术中有效控制眼压，视网膜玻璃体手术中降低HA的粘滞性有效降低手术危险。整形美容领域，透明质酸酶用于除皱或者面部注射透明质酸除皱后不良反应的后处理等。通过将人的HAase基因PH20与溶瘤腺病毒（oncolyticadenovirus，OAV）整合，使HAase发挥作用，降解HA，促进OAV在肿瘤细胞中的扩散，使肿瘤减小，提高疗效〔7〕。人重组HAaserhPH20还可以用于糖尿病治疗中，可加速胰岛素的扩散，更快达到最高作用，有效控制了糖尿病人的血糖浓度。同时，HAase具有很强的生血作用，增强血管的通透性，从而使药物更容易暴露，由于HAase的各种作用，已经广泛应用于临床中。
　　五、总结
　　透明质酸酶是一种广泛分布和被忽视的酶，具有不同的底物特异性，广泛的pH值，不同的催化机制和各种各样的功能。然而，在这一领域已经做了许多的工作，但在酶学方面仍然有很多工作要做，特别是三维结构和定点突变和酶促动力学，以增强对结合位点、底物识别和催化机制的理解。克隆更多的重组酶可以确定这些透明质酸酶的分类和联系。进一步研究纯化后的透明质酸酶的底物的结构，以提高对酶的协同作用的理解。关于表达调控有许多未解的问题，包括完整的基因序列、协调调控的程度以及对假定诱导物反应的分子机制。随着研究的深入，不同来源透明质酸酶的特性被逐渐发掘，这些为预防和治疗透明质酸酶相关疾病提供新的途径和理论依据。
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