酶分子的改造方法初探

　　方超白清博王幸幸
　　摘要：酶工程的研究现在已经发展到分子水平。通过基因工程、化学、物理等手段改造酶分子结构与功能，大幅提高了酶分子的进化效率和催化效率，生产有价值的非天然酶。本文对常见的酶分子的改造方法做了一个简单的介绍，并对酶改造的发展前景做了描述。
　　关键词：酶分子；基因工程；蛋白质；前景
　　一、酶与酶的分子改造
　　（一）酶
　　酶是指以蛋白质为主体的生物催化剂，具有在常温常压和近中性pH等温和条件下，高效率地进行区域或对映体选择性催化的特点。迄今为止，从生物界已发现和定性了近3000种酶，分属氧化还原、转移、水解、裂合、异构、连接六大类。由于酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温和等优点，因此在工业、农业、医药和环保等方面已经得到越来越多的应用。但总体还没有达到大规模应用的程度，其主要原因在于酶自身性质上的一些不足。因此，人们希望通过各种方法、按照需要定向地改造酶分子，甚至创造出自然界尚未发现的新酶，从而满足各行各业的需要。
　　（二）酶的改造
　　在酶的应用过程中，有时会因酶的稳定性差、活力不够理想及具有抗原性等缺点而受到一定的限制，为此常需对酶分子进行适当的改造和加工，以改善酶的性能。酶分子的改造以提高酶的稳定性和活性、增强酶的选择性、改变酶的表面特性为目标。
　　二、改造酶的方法
　　（一）化学修饰法
　　酶分子的化学修饰是指通过主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，其目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。
　　酶在进行化学修饰后，大多数酶的性质会发生一些变化，如热稳定性、抗各类失活因子能力、抗原性、半衰期、最适PH值等。
　　酶修饰中存在的问题是，随着酶与修饰剂结合率提高，酶活回收率将下降。克服的方法是采取一些保护措施，如添加酶的竞争性抑制剂，保护酶活性部位以及改进现有的修饰工艺，进一步完善酶的化学修饰法。
　　化学修饰酶的目标是提高酶活力，改进酶的稳定性，改变酶的特异性，提高催化过程的反应效率。
　　（二）生物酶工程法
　　酶的化学修饰法并非改造酶的惟一手段。随着人们对酶的深入研究以及氨基酸一级结构的测定、基因重组技术的应用等，可以彻底地改造、合成并且模拟酶。这也就是生物酶工程的主要内容。生物酶工程主要包括基因工程技术和蛋白质工程技术。
　　1。基因工程技术改造和生产酶
　　基因工程改造酶分子主要包括三方面内容：用基因工程技术大量生产酶。修饰酶基因，产生遗传修饰。设计出新酶基因，合成自然界从未有过的酶。
　　自从20世纪70年代重组DNA技术的建立，使人们在很大程度上摆脱了对天然酶的依赖。近十年来，基因工程的发展使得人们可以较容易地克隆各种各样天然的酶基因，使其在微生物中高效表达，并通过发酵进行大量生产。目前已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。
　　2。蛋白质工程改造和生产酶
　　蛋白质工程改造和生产酶包括合理设计技术和定向进化技术。
　　合理设计技术是蛋白质工程最早使用的技术，现在也在广泛的使用。合理设计技术要做好三个方面的工作，首先要用结晶学技术来获得蛋白质结晶体，然后利用x射线技术对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的三维结构。其次，借助计算机对蛋白质进行选择修饰，从氨基酸的化学结构预见空间结构，或通过人工智能等其它方法来确定蛋白质和功能的关系，找到要修饰的位点。第三，通过对基因序列的了解，运用定点突变技术来进行碱基替换。通过此法来改变蛋白质的功能，要想获得理想的蛋白质工程产物往往要经过多次分析，替换才能达到目的。
　　定向进化技术是蛋白质工程的新策略，它是在不需要事先了解蛋白质空间结构的情况下通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法。因此它能解决合理设计所不能解决的问题，在生产中的应用越来越受到重视。定向进化是在待进化蛋白质基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中引入突变，构建突变库，凭借定向选择方法，选出所需性质的蛋白质。定向进化实际就是随机突变加上选择，它与自然进化不同，整个过程都是在人为控制下进行的，并且还可以模拟真核细胞中DNA随机拼接这一蛋白质进化过程来加速蛋白质的优化。
　　酶的蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，而且仍需要应用基因工程的全套技术。所不同的是，酶的基因工程主要解决的是酶大量生产的问题，而蛋白质工程则致力于天然蛋白质的改造，制备各种定做的蛋白质，但也要用到基因工程的技术手段。
　　（三）酶分子的定点突变法
　　定点突变需要知道酶蛋白的一级结构及编码序列，并根据蛋白质空间结构知识来设计突变位点。定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。该方法与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。然而，定点突变技术只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因而对酶功能的改造较为有限。
　　三、酶分子改造展望
　　相对于其它各种功能蛋白质，酶的结构与功能研究还处于幼年期，如何对酶蛋白实施分子改造，使它们的性能得到改善，是具有挑战性的课题。近年来，随着抗体酶技术的发展，为酶分子设计提供了一个全新的思路。它打破了化学酶工程和生物酶工程的界限，结合了免疫学、细胞生物学、分子生物学、化学等技术，制备出具有高度专一性及特殊催化活力的新型催化抗体。有资料显示，随着新生物工程技术和噬菌体抗体库技术的发展，将有更先进的重组技术用来直接从抗体库中筛选催化抗体。